STILLA – nowa technologia Crystal Digital PCR

CRYSTAL DIGITAL PCR

Technologia Crystal Digital PCR™ firmy Stilla (Francja) oparta jest podziale próbki na 30 000 lub 17 000  kropli o tej samej wielkości. Pozwala to na jednoczesną i niezależną  amplifikację cząsteczki docelowej  w każdej z wytworzonych kropli w przeciwieństwie do konwencjonalnej metody real – time PCR gdzie amplifikacja odbywa się w jednej probówce (jednej mieszaninie). Technologia ta zapewnia więc zwiększoną czułość i precyzyjną detekcję nawet pojedynczej cząsteczki DNA (lub docelowego parametru) w każdej z kropli oraz zwiększa tolerancję reakcji na inhibitory.

Crystal Digital PCR™ (Stilla) przeważa nad konwencjonalnymi technikami qPCR oraz innymi systemami ddPCR umożliwiając absolutną ocenę ilościową badanych cząstek docelowych (wirusów, alleli itp.) bez potrzeby stosowania krzywych standardowych czy genów referencyjnych. W efekcie otrzymuje się dokładną i precyzyjną analizę ilościową do 6  targetów – parametrów docelowych (wysokie możliwości multipleksowania)  w pojedynczej reakcji, przy jednoczesnym skróceniu czasu uzyskiwania wyników a także oszczędzeniu cennego materiału (próbki). Jednocześnie istnieje możliwość odzyskania wyjściowej próbki nawet po wykonaniu podziału próbki oraz amplifikacji i odczytu a następnie wykorzystanie jej do dalszych analiz.

System Stilla naica dzięki zastosowaniu technologii Crystal Digital PCR zapewnia wysoką precyzję, dokładność i czułość odczytu. Proces analizy wyników przebiega za pomocą intuicyjnego oprogramowania Crystal Miner.

Unikalną cechą oprogramowania Crystal Miner jest możliwość wizualizacji powstałych dropletów, oraz eliminacja manualna przez użytkownika błędnie utworzonych dropletów.  Analiza wyników pozwala na określenie bezwzględnej ilości kopii badanego materiału, przedstawienia wyników w formie tabel i formie graficznej, porównanie wyników z innych próbek. Istnieje również możliwość dokonania kompensacji dla reakcji multipleksowych bez potrzeby zakupu dodatkowych zestawów czy odczynników kompensacyjnych. 

naica® System (Stilla)  jest z powodzeniem wykorzystywany w:

•Biopsji tradycyjnej i płynnej z możliwością detekcji rzadkich mutacji (np. oznaczenie ilościowe sekwencji pochodzących z guza)

•Oznaczanie ilościowe ekspresji genów oraz miRNA

•Dyskryminacji zmienności liczby kopii (CNV)

•Kwantyfikacji bibliotek NGS

•Bezwzględnej kwantyfikacji miana patogenów czy ekspresji genów

System Stilla zapewnia:

Szerokie spektrum diagnostyczne – możliwość multipleksowania – wykrywania do 6 parametrów docelowych jednocześnie (największa liczba określanych parametrów jednocześnie w jednej próbce)

Optymalizacja badania – możliwość odzyskania wyjściowej próbki po wykonaniu emulsji i PCR oraz wykorzystania do dalszych analiz np. NGS

Wiarygodność oznaczeń – tworzenie kropel i amplifikacja odbywa się w tym samym urządzeniu, nie ma potrzeby przenoszenia próbek do termocyklera, brak zagrożenia  kontaminacją

Zwiększone możliwości badawcze – większa czułość metody  Crystal Digital PCR i wykrywanie nawet pojedynczych zmian (pojedynczej kopii wirusa lub np. pojedynczej mutacji)

Jednoznaczne wyniki – łatwość interpretacji przy pomocy dedykowanego, intuicyjnego oprogramowania bez konieczności angażowania bioinformatyków (w porównaniu np. do metody NGS).

Oszczędność czasu –  szybkie narzędzie diagnostyczne. Wynik w ciągu 4 godzin (materiał po izolacji kwasów nukleinowych).

Optymalny koszt badania – bez potrzeby zakupu dodatkowych instrumentów, możliwość odzyskania próbki

Technologia digital PCR została wykorzystana do wielu publikacji i artykułów naukowych, z którymi można się zapoznać klikając w link poniżej:

Sytem Stilla Naica wykorzystuje odczynniki firmy ID Solutions (Francja):

TestNr katOznaczane mutacjeIlość reakcji
Multiplex screening of EGFR (L858R;L861Q; Del19) by dPCR (RUO)IDEGFR(s)SENSI-V2-50L858R, L861Q and Del19 50
Multiplex screening of EGFR (T790M, C797S) by dPCR (RUO)IDEGFR(s)RESIST-50T790M and C797S (cis/trans)50
Multiplex screening of EGFR (S768I, G719X, ins 20) by dPCR (RUO)IDEGFR(s)RARE-50S768I, G719X and ins2050
Multiplex screening of KRAS mutation at codon 12-13 and 61 (RUO)IDKRAS(s)-50KRAS mutations at positions G12, G13 and Q6150
Multiplex screening of NRAS mutation at codon 12-13 and 61 (RUO)IDNRAS(s)-50NRAS‘s mutations at positions G12, G13 and Q6150
Multiplex screening of BRAF mutation between codon 597 and 601 (RUO)IDBRAF(s)-50BRAF‘s mutations at positions L597, A598, V600 and K601, with a distinction of the V600E mutation50
Multiplex screening of PIK3CA by dPCR (RUO)IDPIK3CA(s)-25E542K, E545K, Q546K, H1047R and H1047L25
Multiplex screening of H3F3A by dPCR (RUO)IDH3F3A(s)-25H3F3A ‘s mutations at positions K27M*, G34R* and G34V* (*This numbering follows the histone nomenclature. However, these mutations can be referred to as K28M, G35R and G35V in some scientific publications)25
Multiplex screening of IDH1/2 by dPCR (RUO)IDIDH1/2(s)-25several variants in the both region of IDH1 (R132X – R132H, R132C, R132S, R132G, R132L) and IDH2  (R172X – R172W, R172G, R172K, R172M)25
Multiplex screening of TERT by dPCR (RUO)IDTERT(s)-25 orTERT promoter mutations at position 124 bp and 146 bp upstream of the translation start codon (ATG), corresponding to the C228T and C250T mutations25
Multiplex screening of BRAF by dPCR (RUO)IDBRAF(s)CNS-25V600E mutations (c.1799T>A) and the fusion of the KIAA1549-BRAF genes25
Multiplex screening of FGFR1 by dPCR (RUO)IDFGFR1(s)CNS-25N546K and K656E mutations, exon 8 (unduplicated reference) and exon 16 (duplication) of the FGFR1 gene25