CRYSTAL DIGITAL PCR™
Technologia Crystal Digital PCR™ firmy Stilla (Francja) oparta jest podziale próbki na 30 000 lub 17 000 kropli o tej samej wielkości. Pozwala to na jednoczesną i niezależną amplifikację cząsteczki docelowej w każdej z wytworzonych kropli w przeciwieństwie do konwencjonalnej metody real – time PCR gdzie amplifikacja odbywa się w jednej probówce (jednej mieszaninie). Technologia ta zapewnia więc zwiększoną czułość i precyzyjną detekcję nawet pojedynczej cząsteczki DNA (lub docelowego parametru) w każdej z kropli oraz zwiększa tolerancję reakcji na inhibitory.
Crystal Digital PCR™ (Stilla) przeważa nad konwencjonalnymi technikami qPCR oraz innymi systemami ddPCR umożliwiając absolutną ocenę ilościową badanych cząstek docelowych (wirusów, alleli itp.) bez potrzeby stosowania krzywych standardowych czy genów referencyjnych. W efekcie otrzymuje się dokładną i precyzyjną analizę ilościową do 6 targetów – parametrów docelowych (wysokie możliwości multipleksowania) w pojedynczej reakcji, przy jednoczesnym skróceniu czasu uzyskiwania wyników a także oszczędzeniu cennego materiału (próbki). Jednocześnie istnieje możliwość odzyskania wyjściowej próbki nawet po wykonaniu podziału próbki oraz amplifikacji i odczytu a następnie wykorzystanie jej do dalszych analiz.
System Stilla naica dzięki zastosowaniu technologii Crystal Digital PCR zapewnia wysoką precyzję, dokładność i czułość odczytu. Proces analizy wyników przebiega za pomocą intuicyjnego oprogramowania Crystal Miner.
Unikalną cechą oprogramowania Crystal Miner jest możliwość wizualizacji powstałych dropletów, oraz eliminacja manualna przez użytkownika błędnie utworzonych dropletów. Analiza wyników pozwala na określenie bezwzględnej ilości kopii badanego materiału, przedstawienia wyników w formie tabel i formie graficznej, porównanie wyników z innych próbek. Istnieje również możliwość dokonania kompensacji dla reakcji multipleksowych bez potrzeby zakupu dodatkowych zestawów czy odczynników kompensacyjnych.
naica® System (Stilla) jest z powodzeniem wykorzystywany w:
•Biopsji tradycyjnej i płynnej z możliwością detekcji rzadkich mutacji (np. oznaczenie ilościowe sekwencji pochodzących z guza)
•Oznaczanie ilościowe ekspresji genów oraz miRNA
•Dyskryminacji zmienności liczby kopii (CNV)
•Kwantyfikacji bibliotek NGS
•Bezwzględnej kwantyfikacji miana patogenów czy ekspresji genów
System Stilla zapewnia:
•Szerokie spektrum diagnostyczne – możliwość multipleksowania – wykrywania do 6 parametrów docelowych jednocześnie (największa liczba określanych parametrów jednocześnie w jednej próbce)
•Optymalizacja badania – możliwość odzyskania wyjściowej próbki po wykonaniu emulsji i PCR oraz wykorzystania do dalszych analiz np. NGS
•Wiarygodność oznaczeń – tworzenie kropel i amplifikacja odbywa się w tym samym urządzeniu, nie ma potrzeby przenoszenia próbek do termocyklera, brak zagrożenia kontaminacją
•Zwiększone możliwości badawcze – większa czułość metody Crystal Digital PCR i wykrywanie nawet pojedynczych zmian (pojedynczej kopii wirusa lub np. pojedynczej mutacji)
•Jednoznaczne wyniki – łatwość interpretacji przy pomocy dedykowanego, intuicyjnego oprogramowania bez konieczności angażowania bioinformatyków (w porównaniu np. do metody NGS).
•Oszczędność czasu – szybkie narzędzie diagnostyczne. Wynik w ciągu 4 godzin (materiał po izolacji kwasów nukleinowych).
•Optymalny koszt badania – bez potrzeby zakupu dodatkowych instrumentów, możliwość odzyskania próbki
Technologia digital PCR została wykorzystana do wielu publikacji i artykułów naukowych, z którymi można się zapoznać klikając w link poniżej:
Sytem Stilla Naica wykorzystuje odczynniki firmy ID Solutions (Francja):
| Test | Nr kat | Oznaczane mutacje | Ilość reakcji |
| Multiplex screening of EGFR (L858R;L861Q; Del19) by dPCR (RUO) | IDEGFR(s)SENSI-V2-50 | L858R, L861Q and Del19 | 50 |
| Multiplex screening of EGFR (T790M, C797S) by dPCR (RUO) | IDEGFR(s)RESIST-50 | T790M and C797S (cis/trans) | 50 |
| Multiplex screening of EGFR (S768I, G719X, ins 20) by dPCR (RUO) | IDEGFR(s)RARE-50 | S768I, G719X and ins20 | 50 |
| Multiplex screening of KRAS mutation at codon 12-13 and 61 (RUO) | IDKRAS(s)-50 | KRAS mutations at positions G12, G13 and Q61 | 50 |
| Multiplex screening of NRAS mutation at codon 12-13 and 61 (RUO) | IDNRAS(s)-50 | NRAS‘s mutations at positions G12, G13 and Q61 | 50 |
| Multiplex screening of BRAF mutation between codon 597 and 601 (RUO) | IDBRAF(s)-50 | BRAF‘s mutations at positions L597, A598, V600 and K601, with a distinction of the V600E mutation | 50 |
| Multiplex screening of PIK3CA by dPCR (RUO) | IDPIK3CA(s)-25 | E542K, E545K, Q546K, H1047R and H1047L | 25 |
| Multiplex screening of H3F3A by dPCR (RUO) | IDH3F3A(s)-25 | H3F3A ‘s mutations at positions K27M*, G34R* and G34V* (*This numbering follows the histone nomenclature. However, these mutations can be referred to as K28M, G35R and G35V in some scientific publications) | 25 |
| Multiplex screening of IDH1/2 by dPCR (RUO) | IDIDH1/2(s)-25 | several variants in the both region of IDH1 (R132X – R132H, R132C, R132S, R132G, R132L) and IDH2 (R172X – R172W, R172G, R172K, R172M) | 25 |
| Multiplex screening of TERT by dPCR (RUO) | IDTERT(s)-25 or | TERT promoter mutations at position 124 bp and 146 bp upstream of the translation start codon (ATG), corresponding to the C228T and C250T mutations | 25 |
| Multiplex screening of BRAF by dPCR (RUO) | IDBRAF(s)CNS-25 | V600E mutations (c.1799T>A) and the fusion of the KIAA1549-BRAF genes | 25 |
| Multiplex screening of FGFR1 by dPCR (RUO) | IDFGFR1(s)CNS-25 | N546K and K656E mutations, exon 8 (unduplicated reference) and exon 16 (duplication) of the FGFR1 gene | 25 |
Instrument all-in-one NIO+
Stilla Technologies rozszerzyła swoje portfolio o instrument all-in-one – NIO plus.
Obecnie zaproponowano ten instrument w trzech wariantach tak aby sprostać potrzebom użytkowników w zakresie przepustowości. Instrumenty NIO Family:
Nio™ Digital PCR family to linia wszechstronnych, cyfrowych urządzeń PCR typu „wszystko w jednym” o niezrównanej łatwości obsługi i dostępnych w 3 konfiguracjach, aby zaspokoić potrzeby każdego laboratorium w zakresie przepustowości.
Technologia, znana jako Crystal Digital PCR, dzieli próbki na tysiące pojedynczych kryształów – kropelek – każdy z własnym przedziałem reakcyjnym. Reakcje te są znakowane fluoroforami, które można odczytać za pomocą maksymalnie siedmiu różnych kanałów światła fluorescencyjnego.
Systemy Nio™ to jedyne instrumenty dPCR z aż 7 kanałami fluorescencji dzięki czemu mamy możliwość oznaczenia nawet 4 x więcej targetów w pojedynczym teście.
Systemy Nio™ zapewniają technologię odczytu do siedmiu sygnatur fluorescencyjnych w jednym dołku reakcyjnym. Pozwala to na opracowanie testów do wykrywania i indywidualnego oznaczania ilościowego nawet do 28 targetów jednocześnie. Oszczędza to zarówno czas, pieniądze jak i cenną próbkę.
Kontrola jakości przebiegu badania oparta jest na sztucznej inteligencji
Oprogramowanie Nio™ Reader wykorzystuje technologię AI do zliczania kropelek i kontroli jakości kryształów Droplet Crystal.
Oprogramowanie Nio™ Analyzer zapewnia intuicyjne wizualizacje analizy obrazu, umożliwiając dokładną eksplorację kryształów Droplet Crystals w celu dalszej kontroli jakości. Oprogramowanie Nio™ Analyzer mierzy stężenia docelowych kwasów nukleinowych, zapewniając automatyczną identyfikację kropli dodatnich i ujemnych dla wszystkich kanałów fluorescencji.
Wraz z możliwością odczytu danych ułożonych wzdłuż wykresów punktowych 1D, 2D i 3D, oprogramowanie systemu Nio™ zapewnia dostęp do surowych danych w celu wyeksportowania wszystkich szczegółów eksperymentu i wyników.
Użytkownik ma możliwość wyboru standardowej wersji oprogramowania lub oprogramowania zgodnego z 21 CFR część 11 (co jest szczególnie istotne w produkcji wyrobów farmaceutycznych).
Systemy NIO + dostosowane są do przepustowości laboratorium
Nio™ E umożliwia sekwencyjne uruchamianie płytki z chipami (48 próbek).
Nio™ możliwość wsadu 4 płytek z chipami na raz. Każda po 48 próbek. Łącznie 192 próbki.
Nio™+ możliwość wsadu 8 płytek z chipami (384 próbki) jednocześnie lub partiami, niezależnie od tego, czy urządzenie przeprowadza eksperyment, czy nie. Zespół laboratoryjny może przygotowywać eksperymenty na działającym urządzeniu lub w spokoju na dowolnym komputerze w biurze laboratorium.
Systemy Nio+ przyjazne są automatyzacji
Płytki Ruby Chip działają podobnie jak standardowe płytki SBS. Mogą pomieścić 48 próbek, są oddalone od siebie o 9 mm, dzięki czemu pasują do pipet wielokanałowych i doskonale współpracują z istniejącymi urządzeniami takimi jak Tecan, Hamilton, Opentrons.
System All in One – wystarczy nacisnąć Play
Genrator kropli, termocykler i czytnik fluorescencji znajdują się w jednym urządzeniu. Chipy wypełnione są już olejem dlatego należy dodać tylko mieszaninę reakcyjną do komór chipa na płytce, włożyć płytkę do instrumentu i czekać na wynik.
Nio™ jest jednym z najmniejszym urządzeniem all-in-one do digital PCR w swojej klasie. Zajmuje zaledwie 56 cm na 67 cm, zmieści się nawet w najmniejszym laboratorium
Systemy Nio pracują tylko z chipami Ruby, na które to również przygotowywane są customowe testy Flex Probes. Portfolio tych testów zwiększa się i wszystkie z nich są kompatybilne z systemami NIO family.
Zastosowanie instrumentu NIO+ gwarantuje:
Znaczną oszczędność czasu dzięki:
- jednemu instrumentowi, który zarówno generuje krople, przeprowadza PCR a także odczytuje badaną fluorescencję
- gotowym do użycia chipom wypełnionych olejem
- wysokiej przepustowości instrumentu od 48 do 384 próbek w zależności od modelu systemu
Zwiększone możliwości multipleksowania – dzięki 7 kolorom fluorescencji oraz możliwości wykorzystania hyper multiplekowania (do 28 tragetów w jednej próbce)
Szerokie możliwości analizy wyników dzięki łatwemu, intuicyjnemu oprogramowaniu, możliwości wglądu w surowe dane, możliwości łączenia poszczególnych miejsc w chipie w jedną próbkę i analizowaniu jej jednocześnie
Elastyczność pracy dzięki:
- możliwości umieszczania dowolnej liczby płytek (do 8) z chipami Ruby w dowolnym momencie, niezależnie od tego czy przyrząd przeprowadza eksperyment czy nie.
- możliwości automatyzacji
Optymalny koszt badania – bez potrzeby zakupu dodatkowych instrumentów, cały proces zachodzi w jednym urządzeniu
Wiarygodność oznaczeń – tworzenie kropel, amplifikacja i odczyt odbywa się w tym samym urządzeniu, nie ma potrzeby przenoszenia próbek do termocyklera, brak zagrożenia kontaminacją